本试剂盒仅供科研使用
谷*酸脱羧酶（GAD）测定试剂盒说明书
（货号：WS2011F分光法24样）一、产品简介：谷*酸脱羧酶(GAD，EC 4.1.1.15)是一种吡哆醛类裂解酶，能专一的催化L-谷*酸裂解成为γ-氨基丁酸(GABA)和CO2。GAD广泛分布于动植物和微生物中：哺乳动物体内GAD催化产生的GABA是一种重要的抑制性神经递质；在植物中GAD的活性高低可指示种子发芽能力和出苗率等。本试剂盒利用苯*和次氯酸钠比色法测定谷*酸脱羧酶（GAD）催化产生的GABA，最终生成蓝色物质，该物质在645nm处有明显光吸收，其颜色深浅与GABA含量呈正比，进而得出GAD活力大小。二、试剂盒组成和配制：试剂名称规格保存要求备注提取液液体30mL×1瓶4℃保存试剂一粉体mg×1瓶4℃保存临用前甩几下，使粉体落到底部，再加入6mL试剂二溶解备用。试剂二液体12mL×1瓶4℃保存试剂三液体20mL×1瓶4℃保存试剂四液体1.5mL×1瓶4℃保存试剂五液体12mL×1瓶4℃保存试剂六A：液体4.4mL×2瓶B：液体5mL×1瓶4℃保存临用前取2.2mL的B液进一瓶A液中，混匀后作为试剂六使用。混匀后的试剂半个月内用完。标准品粉体mg×1支4℃保存若重新做标曲，则用到该标曲。三、所需的仪器和用品：可见分光光度计、1mL玻璃比色皿（光径1cm）、水浴锅、离心机、可调式移液器。四、谷*酸脱羧酶（GAD）活性测定：建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！1、 样本制备：① 组织样本：取约0.1g组织，加入1mL提取液，冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心10min，取上清液待用。② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；12000rpm 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。③ 液体样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。2、 上机检测：① 可见分光光度计预热30min以上，调节波长至645nm，蒸馏水调零。② 在EP管依次加入：试剂名称（μL）测定管对照管样本100100试剂一200试剂二200混匀，40℃孵育30min。本试剂盒仅供科研使用2试剂三200200混匀，室温12000rpm，离心3min，上清液待测。③ 显色反应：在EP管中依次加入：上清液200200试剂三125125试剂四2525试剂五200200试剂六200200混匀，20℃放置20min，取全部澄清上清液至1mL玻璃比色皿（光径1cm）中，于645nm处读取各管的A值，△A=A对照-A测定(每个样本需做一个自身对照)。【注】若ΔA值在零附近，可增加样本质量W（如增至0.2g），或延长40℃孵育时间T（如增至1h或更长），或加大样本量V1（如增至300μL，则试剂三相应减少），则改变后的W和T和V1需代入计算公式重新计算。五、结果计算：1、标准曲线：y = 2.0976x - 0.0059，x为标准品摩尔质量(μmol)，y为吸光值ΔA。2、按样本蛋白浓度计算：单位定义：每毫克组织蛋白每分钟产生1nmol的GABA定义为一个酶活力单位。GAD(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0059)÷2.0976]×(V2÷V3)÷(V1×Cpr)÷T×103=397.3×(ΔA+0.0059)÷Cpr3、按样本鲜重计算：单位定义：每克组织每分钟产生1nmol的GABA定义为一个酶活力单位。GAD(nmol/min/g鲜重)=[(ΔA+0.0059)÷2.0976]×(V2÷V3)÷(W×V1÷V)÷T×103=397.3×(ΔA+0.0059)÷W4、按细胞数量计算：单位定义：每104个细胞每分钟产生1nmol的GABA定义为一个酶活力单位。GAD(nmol/min/104cell)=[(ΔA+0.0059)÷2.0976]×(V2÷V3)÷(500×V1÷V)÷T×103=0.8×(△A+0.0059)5、按照液体体积计算：单位定义：每毫升液体每分钟产生1nmol的GABA定义为一个酶活力单位。GAD(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0059)÷2.0976]×(V2÷V3)÷V1÷T=397.3×(ΔA+0.0059)V---提取液体积，1mL；V1---加入反应体系中样本体积，0.1mL；V2---反应体系总体积：0.5mL；V3---第②步显色阶段上清液量，0.2mL；T---反应时间，30min；W---样本质量，g；标准品GABA分子量---103.12；500---细胞数量，万；Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL，建议使用本公司的BCA蛋白含量检测试剂盒。附：标准曲线制作过程：1标准品母液（1mg/mL）：向EP管中加入2mL蒸馏水；把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0,0.06, 0.12, 0.18, 0.24, 0.3 mg/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。2按照显色反应阶段的测定管加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。